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蛋白印迹的一些常见注意事项是哪些?
1. 一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景;单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。
2. 如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm(厚度超过2.0mm时，凝胶转移效率受限);也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。
3. 滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率;上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。
4. 如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间;并考虑延长每一步的清洗时间。
5. 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定佳条件。
6. 一般情况使用0.45μm的NC膜，0.1～0.2μm的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质。
7. PVDF尼龙膜较NC膜柔软、结实、灵敏度高，易于操作且蛋白质结合能力强(PVDF膜可结合蛋白质480μg/cm2，而NC膜只能结合蛋白质80μg /cm2);缺点是PVDF尼龙膜背景也高，需要加强封闭;此外，PVDF尼龙膜若在使用前先行甲醇处理5～10s，以活化膜表面的正电基团，使它更容易与带负电的蛋白质结合，可提高蛋白质在膜上的保留指数。
8. 使用化学发光检测时，试剂须按需要量临用前配置混合。
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